В предишния раздел обсъдихме реакцията антиген – антитяло in vivo. Тази реакция се извършва и в лабораторни условия като експеримент или диагностичен тест. Сега ще разгледаме накратко някои имунологични методи, които измерват наличието или съдържанието на комплекса антиген – антитяло.

         При всеки от методите, регистриращи реакцията антиген – антитяло, има две възможности: да се търси антигенът чрез тест-антитяло (серум или моноклонално антитяло, за което знаем, че разпознава този антиген), или да се търси антитялото чрез тест-антиген (препарат, за който знаем, че съдържа антигена). Освен това методите могат да се провеждат качествено или количествено. Качественият метод показва само дали антигенът (антитялото) присъства или отсъства, докато количественият метод показва и неговата концентрация.

1. Аглутинация

         Аглутинация наричаме реакцията на антитяло с антиген на повърхността на клетки или други сравнително едри частици, водеща до слепването на тези частици.

         В отсъствие на антитела клетките в суспензия не се слепват една с друга, понеже повърхността им е отрицателно заредена и те се отблъскват. Ако разтворът е по-малко плътен от клетките (както е обикновено), те в крайна сметка се утаяват на дъното на съда, но при разклащане отново се суспендират.

         Ако обаче към клетките се добавят антитела срещу повърхностни антигени на клетките, положението се променя. Антитялото има поне два активни центъра и може да се свърже едновременно с две клетки, образувайки мост между тях. Така то ги сближава, преодолявайки електростатичното отблъскване. Други антителни молекули могат да свържат някоя от тези две клетки с трета. Процесът продължава и се образува голям тримерен агрегат от клетки, наречен аглутинат. Оставен да падне на дъното, той образува широка утайка с неравни, рязко очертани краища. При разклащане на съда не се възстановява суспензията, а се получават отделни плътни парцалчета от аглутинирани клетки. Те се виждат с просто око и при по-нататъшно разклащане често стават още по-едри, като присъединяват нови клетки и се сливат помежду си.

         Добре аглутинират антителата от клас IgM, понеже имат голяма и многовалентна молекула. Понякога и антителата IgG могат да осъществят аглутинация, но не винаги.

         Аглутинацията се използва например за определяне на кръвни групи, което ще разгледаме по-подробно в специално посветен раздел.

         Аглутинацията освен качествено може да се проведе и количествено, за да се установи колко антитела срещу дадения антиген съдържа изследваният серум. Клетките се оставят да реагират с различни разреждания на серума и се следи кога престава да се вижда аглутинация. Методът се нарича титруване на серум. Прави се върху плаки с ямки, чиито стени са скосени, а дъната – конични. Погледната отгоре, положителната реакция (т.е. аглутинацията) се вижда като широко петно, най-плътно по периферията. При отрицателна реакция (т.е. при липса на аглутинация) клетките просто се утаяват във вид на кръгла точка, най-плътна в средата.

         При титруването в първата ямка може да се сложи неразреден серум. Във втората към серума се добавя равен обем физиологичен разтвор и се получава разреждане 1:2. В третата ямка разреждането е 1:4 и т.н. Положителната реакция става все по-слабо изразена, докато изчезне. Последното разреждане, при което все още се вижда аглутинация, се нарича титър на серума.

2. Преципитация

         Преципитация наричаме реакцията на антитяло с разтворен антиген, която води до образуване на голям мрежовиден комплекс от двата вида макромолекули. Този комплекс, наречен преципитат, може да се види с просто око като бяла утайка. Той е сравнително устойчив, макар да се основава на нековалентни връзки между разтворими молекули.

         От техническа гледна точка преципитацията е по-сложна от аглутинацията – не само защото преципитатите се виждат по-трудно от аглутинатите, а и защото получаването им изисква определено съотношение на антигена и антитялото. Съвсем не всеки комплекс антиген – антитяло е преципитат. При голям излишък на който и да е от двата реагента вместо преципитати ще се получат малки комплекси от по няколко молекули. Например при излишък на антигена всяко антитяло от клас IgG ще свърже по една молекула антиген с двата си активни центъра, давайки тримолекулен комплекс. При излишък на антитялото то ще насити антигенните детерминанти на всяка молекула антиген и така отново ще се получат малки, добре разтворими и невидими комплекси. Само при приблизително равни количества антиген и антитяло, в т. нар. зона на еквивалентност, ще се получи годен за анализ преципитат.

         Първоначално методът е бил провеждан, като в няколко епруветки е било наливано равно количество разтвор на антитялото и във всяка от тях е било добавяно различно количество антиген. При това някоя от епруветките е улучвала зоната на еквивалентност и е давала видим преципитат. Малко по-удобен начин да се провежда преципитация в разтвор е т. нар. ринг-тест (пръстенен тест). Разтворите на двата реагента се наслояват внимателно един върху друг в тясна епруветка, която не позволява турбулентното им смесване. Тя се оставя за известно време, за да може чрез дифузия молекули антиген да проникнат в разтвора на антитялото и обратно. На границата на двата разтвора се получава преципитат, видим като белезникав пръстен.

         Преципитацията в разтвор обаче е доста непрактична и днес има най-вече историческо значение. Предпочита се реакцията да се провежда в агаров гел. Това забавя скоростта й, но я прави по-контролируема и разширява възможностите за анализ.

         Преципитацията в гел има няколко варианта. Един от тях по своята постановка е близък до ринг-теста. Нарича се метод на Ухтерлони (Ouchterlony). В агаровия гел се издълбават две ямки и в тях се накапват съответно антигенът и антитялото. Оставя се да престои. Всяка от макромолекулите прониква в гела във все по-широк кръг около своята ямка, поради което методът се нарича още двойна имунодифузия. Когато се пресрещнат, те образуват в гела преципитат във вид на ивица.

         Често "антигенът" е тъканен извлек, съставен от най-различни белтъци, а "антитялото" е серум, съдържащ антитела срещу няколко компонента на тази тъкан. Тогава между ямките на антигена и антитялото ще се очертаят няколко успоредни ивици, отговарящи на различните комплекси антиген – антитяло.

         Чрез метода на Ухтерлони може да се изследва степента на прилика между два белтъка, например говежди и човешки серумен албумин. В гела се правят три ямки, в които се слагат съответно двата изследвани белтъка (Ag₁ и Ag₂) и антитяло срещу единия от тях (анти-Ag₁). След това по получените ивици се съди дали и в каква степен антитялото е реагирало и с другия белтък (Ag₂).

         Друга разновидност на преципитацията в гел е т. нар. единична радиална имунодифузия или метод на Манчини (Mancini). При нея антитялото се включва в самия агаров гел. След това се прави ямка и се нанася антигенът. Той дифундира в гела и дава преципитат във вид на окръжност. Чрез този метод се мери количеството антиген. Колкото повече е антигенът, толкова по-широка е получената окръжност.

         Описаните дотук методи, макар все още да се използват, са "методи на вчерашния ден" на имунологията. По-модерните са тези, чиито описание следва.

3. Радиоимуноанализ (РИА)

         Радиоимуноанализът, съкратено РИА или RIA (от англ. radioimmunoassay) е количествен метод за измерване на антигена. Той е извънредно чувствителен и се използва за засичане на хормони, невропептиди и други биологично активни съединения, чието съдържание в телесните течности е много ниско.

         За радиоимуноанализ освен високо-афинитетно антитяло трябва и пречистен антиген, белязан с радиоактивен изотоп. В две епруветки се слага определено количество от този белязан антиген. Добавя се ограничено количество антитяло – например толкова, че да свърже 70% от антигена. Едната епруветка се оставя в този вид – тя е контрола. В другата се добавя пробата, в която искаме да измерим количеството антиген. Този добавен небелязан антиген със засега неизвестно съдържание ще се конкурира с белязания антиген за ограничения брой антиген-свързващи центрове на антитялото.

         След като се даде време на реакцията да протече, получените комплекси антиген – антитяло се събират в утайка и така се отделят от свободния антиген. (Няма да се спираме на начина, по който се постига това.) Радиоактивността на утайката се измерва. За пробата тя ще е по-ниска, отколкото за контролата, и то толкова по-ниска, колкото повече антиген е съдържала пробата. Причината е, че небелязаният антиген от пробата се е настанил върху антитялото (и съответно в утайката) на мястото на част от белязания антиген. От разликата между проба и контрола се изчислява количеството небелязан антиген в пробата.

         Сега е ясно защо при РИА антитялото трябва да бъде в недостиг спрямо антигена. Ако антитялото е в излишък, то ще свърже целия антиген, белязан и небелязан. Тогава няма да се засече разлика между проба и контрола и нищо няма да се разбере.

4. Методи, основани на белязани антитела. ЕЛАЙЗА

         При цял набор от имунологични методи реакцията антиген – антитяло се установява чрез белязани антитела. Обикновено се белязва не самото антитяло, което реагира с антигена и се нарича първо антитяло, а специално получено анти-имуноглобулиново антитяло, което реагира с първото антитяло и се нарича второ антитяло. Така методът сумарно включва най-малко три етапа: (1) реакция на първото антитяло с антигена, (2) реакция на второто антитяло с първото антитяло и (3) проявяване на белега на второто антитяло.

         Вече сме разгледали два важни метода от тази група: имуноцитохимията в раздел Белтъци – методи за изследване и имуноблота в раздел Генно инженерство. Сега ще разгледаме ензимно-свързания имуносорбентен анализ, често наричан ЕЛАЙЗА (англ. ELISA, съкр. от enzyme-linked immunosorbent assay). За разлика от имуноцитохимията и имуноблота ЕЛАЙЗА не е много информативна – не показва нито клетъчната локализация, нито молекулната маса на антигена. За сметка на това тя е удобна за рутинни клинични тестове и може да се провежда не само като качествен, а и като количествен метод. Както личи от името й, белегът на второто антитяло е ензим.

         ЕЛАЙЗА също като титруването се провежда в плаки с многобройни ямки, но тук дъната на ямките са плоски. Плаките са от пластмаса, върху която белтъците са склонни да се адсорбират. Първо в ямките се налива разтвор на антигена и се оставя за известно време, за да може част от него да се залепи върху дъната и стените на ямките. След това остатъкът от антигена се изсмуква. Ямките за известно време се запълват с разтвор на някакъв индиферентен белтък, най-често говежди серумен албумин. Неговата роля е да покрие (блокира) пластмасата, за да не може никой от следващите реагенти да се адсорбира върху нея неспецифично.

         Ямките отново се изпразват и в тях се нанася разтворът на първото антитяло. Дава му се време да реагира с антигена, след което се изсмуква и ямките се промиват. Слага се второто антитяло, отново се оставя да престои и се промива. Добавя се субстрат за цветна реакция, катализирана от ензима, с който е белязано второто антитяло. За разлика от имуноблота тук не е нужно цветният продукт да бъде неразтворим – ямката със същия успех може да вмести и разтворим продукт.

         На различните етапи от реакцията се оставят контроли – ямки без антиген, първо антитяло или/и второ антитяло. След като цветната реакция се развие, ямките-проби се сравняват с контролите. Грубо впечатление от резултата може да се получи и на око, а точното му отчитане става с фотометър. Има специални фотометри за тази цел, наречени "четци на ЕЛАЙЗА", в които вместо традиционната кювета се слага самата плака.

         ЕЛАЙЗА спада към т. нар. твърдофазови имунологични методи. Общо за тях е, че в началото антигенът или антитялото се адсорбира върху някаква повърхност. После на всеки етап реагентите, които не са се свързали специфично, могат лесно да се отмият, докато свързаните остават в комплекс върху повърхността.

5. Поточна цитометрия (флоу-цитометрия)

         Поточната цитометрия, често наричана с англицизма "флоу-цитометрия" (от flow cytometry), анализира клетки чрез белязани с флуорохром антитела. По своя принцип обаче тя доста се отличава от имунофлуоресценцията и другите споменати по-горе методи, също основани на белязани антитела. Изследваните клетки в общия случай са живи, намират се в суспензия и анализът им се извършва автоматично.

         Първо суспензията от клетки се оставя да реагира с белязаните антитела. Тези клетки, които носят на повърхността си съответни антигени, ще се покрият с антитела. Клетките, които не експресират въпросните антигени, ще останат небелязани. Обикновено чрез поточна цитометрия се изследва хетерогенна суспензия, в която се очаква да има клетки и от единия, и от другия тип.

         След това клетките постъпват в тънка тръбичка, така че да се движат в колона по една. На определено място тръбичката се осветява от лазерен лъч. Всяка клетка, преминавайки през това място, разсейва светлината на лазера. Освен това, ако е свързала антитялото, тя ще излъчи и флуоресцентна светлина.

Двата типа светлина – разсеяна и излъчена, се анализират автоматично. Така се установява какъв процент от клетките в суспензията са реагирали с белязаните антитела.

         Някои апарати за поточна цитометрия могат не само да анализират клетките, а и да ги сортират според това дали са излъчили флуоресцентен сигнал или не. За целта след лазерния лъч потокът от тръбичката се разделя на отделни капки, съдържащи само по една клетка. На капките, съдържащи флуоресциращи клетки, се придава електричен заряд. След това чрез заредени пластинки тези капки се отклоняват от потока на незаредените капки и се събират в отделна епруветка. Така например, ако имаме суспензия от някакъв лимфоиден орган и белязано анти-имуноглобулиново антитяло, можем да преброим В-лимфоцитите в суспензията и да ги отделим от всички други клетки.

         Макар че анализира клетките поотделно, поточната цитометрия много бързо дава резултат за цялата суспензия. Този метод е с големи възможности и основният фактор, ограничаващ приложението му, е високата цена на апарата.